SILAC技術原理

SILAC(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture)是一種細胞培養條件下的穩定同位素標記技術。利用含輕、中或重型同位素標記的必需氨基酸（主要是賴氨酸Lys和精氨酸Arg）培養基培養細胞，標記細胞內新合成的蛋白質，培養7代以上，細胞中幾乎所有蛋白質都被標記。等量混合各類型蛋白質,酶解后進行LC-MS/MS分析，即可得到肽段及蛋白的定性和相對定量結果。

SILAC技術實驗流程

SILAC實驗技術應用

1、蛋白鑒定和定量；
2、差異蛋白的篩選和鑒定。

SILAC技術實驗*輝駿服務優勢

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近十年服務經驗，眾多服務案例，服務成果得到優秀期刊認可

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SILAC技術實驗服務信息

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SILAC實驗 客戶文獻

1. Gu C.M. et al: Discovery of the Oncogenic Parp1, a Target of bcr-abl and a Potential Therapeutic, in mir-181a/PPFIA1 Signaling Pathway. Molecular Therapy: Nucleic Acids. 2019，IF= 5.66. 【研究內容】：miR-181a在白血病特別是慢性粒細胞白血?。–ML）中表達下調，并影響疾病發展、耐藥性和預后，但其靶基因的分子機制尚不清楚。該文章通過基因芯片，SILAC蛋白組學等方法聯合分析，發現PPFIA1是miR-181a的直接靶基因。CoIP-MS等后續實驗發現，PARP1會結合PPFIA1，抑制PPFIA1或PARP1能夠下調c-KIT水平，抑制CML細胞生長，并延長小鼠存活期。研究揭示PPFIA1和PARP1或成為潛在的CML治療靶點。 使用技術：穩定同位素標記（SILAC）蛋白質組學實驗、silac蛋白組、silac標記定量實驗服務

2. Guo, H.C. et al: Quantitative Proteomic Analysis of BHK-21 Cells Infected with Foot-and-Mouth Disease Virus Serotype Asia 1. PLoS ONE. 2015，IF=3.569. 【研究內容】：研究者通過穩定同位素標記技術(SILAC)定量研究了亞洲1型口蹄疫病毒(FMDV)感染BHK-21細胞后宿主細胞基因表達的變化，從結果中選擇6個變化顯著的蛋白（其中VPS28、PKR、EVI5為下調，LYPLA1、SEC62和DARS為上調）做進一步研究。Western blot、RT-PCR等試驗驗證了這些蛋白在口蹄疫病毒復制過程中的功能重要性，提示口蹄疫病毒感染可能通過影響細胞特異性蛋白的表達，為口蹄疫病毒感染創造更有利的條件。 使用技術：SILAC蛋白質組學分析、SILAC實驗、silac蛋白組檢測外包

3. Fan, H. et al. Quantitative proteomics using stable isotope labeling with amino acids in cell culture reveals protein and pathway regulation in porcine circovirus type 2 infected PK-15 cells. J Proteome Res. 2012，IF=4.564. 【研究內容】：豬圓環病毒2型(PCV2)是引起豬圓環病毒病(PCVD)的主要病原。為揭示PCV2的致病機制和病毒與宿主的相互作用，研究者采用穩定同位素標記(SILAC)結合LC-?MS/MS技術，對PCV2感染的PK-15細胞進行了定量蛋白質組學研究，并構建了PCV2感染的PK-15細胞的蛋白質調控網絡。研究有助于理解PCV2感染的致病機制和宿主細胞的分子反應，為預防PCV2感染提供新的方法。 使用技術：質譜 silac實驗、silac實驗服務

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中文標題：在mir-181a/PPFIA1信號通路中發現致癌的PARP1，或成為BCR-ABL的靶點并有著潛在的治療作用

發表期刊：Mol Ther Nucleic Acids

影響因子：7.032

發表時間：2019年

合作單位：暨南大學醫學院

運用技術：SILAC定量蛋白質組學（由輝駿生物提供技術支持）

● 研究背景

慢性粒細胞白血病(CML)是一種克隆性骨髓增生性疾病，每10萬人中約有1-2人，占成人白血病總數的15%。MIR-181a在白血病中表達下調，并影響其進展、耐藥性和預后，然而，其靶點在白血病，特別是慢性粒細胞白血病(CML)中的確切作用機制尚不清楚。

● 研究路線

● 研究結果

1.     MiR-181a在CM中的直接靶基因PPFIA1

為了確定miR-181a在健康血細胞、人類CML樣本和CML細胞系中的表達水平，研究者首先提取了總RNA，并進行了qPCR分析。結果顯示，miR181a在人CML樣本和CML細胞系中的表達低于其在健康人外周血單個核細胞(PBMC)中的表達(圖1A)，表明miR-181a的下調可能在白血病發生中起重要作用。接下來，研究者將SILAC-液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)和基因芯片分析相結合，系統地研究了miR-181a過表達對CML細胞株K562的影響(圖1C)。SILAC-LC-MS/MS分析表明，重新導入miR181a后，K562細胞中有6000多個蛋白表達下調。然后，用miR-181a模擬物及陰性對照(NC)轉染K562細胞后進行基因芯片分析，發現miR-181a模擬轉染組有1500多個基因表達下調。為了進一步篩選K562細胞中miR-181a的潛在靶點，研究者結合miRNA預測、SILAC-LCMS/MS和基因芯片方法，確定了15個候選miR-181a靶基因。其中，PPFIA1被選作進一步分析(圖1D和1E)。

RT-PCR檢測miR-181a是否能下調K562細胞中PPFIA1mRNA的表達，結果顯示，轉染miR-181a模擬物RNA或PPFIA1小干擾RNA(SiRNA)的K562細胞的PPFIA1mRNA水平明顯低于陰性對照組。隨后，WB檢測miR-181a對PPFIA1蛋白表達的影響，結果顯示，MiR-181a和PPFIA1-siRNA的過表達導致PPFIA1蛋白水平降低(圖1F)。為了確定PPFIA1的3’UTR是否含有功能性miR-181a靶序列，以及這些序列與miR-181a之間是否發生了直接相互作用，研究者進行了雙熒光素酶報告分析。結果如圖1G所示，在293T細胞中，miR-181a轉染可顯著降低psi-Check-PPFIA1-3’UTR的熒光素酶活性，但不能顯著降低psi-CHECKPPFIA1-MUT-3’UTR的熒光素酶活性。這些結果表明，PPFIA1可能是K562細胞中miR-181a的直接靶點。

圖1

2. PPFIA1或miR-181a在慢性粒細胞白血病惡性進展中的作用

接下來，研究者比較了慢性粒細胞白血病細胞和外周血單個核細胞中PPFIA1mRNA的水平。結果如圖1B所示，受試CML細胞和人CML樣本中PPFIA1水平較高。接下來，研究者分別在K562細胞中轉染PPFIA1 siRNA和miR-181a模擬物，結果顯示，MiR-181a轉染組和PPFIA1 siRNA轉染組均以濃度依賴的方式有效增加K562細胞對IM處理的敏感性(圖2A)。Transwell分析還顯示，經miR-181a模擬或PPFIA1 siRNA處理后，CML細胞的侵襲能力顯著降低(圖2B)。最后，轉染miR-181a模擬物和PPFIA1 siRNA的K562細胞集落形成能力均明顯低于NC組(圖2C)。

為了探討PPFIA1在CML中的高表達是否與療效有關，研究者用四甲基偶氮唑鹽比色法分析了IM作用48h后過表達PPFIA1的K562細胞對IM的敏感性，結果顯示過表達PPFIA1明顯抑制IM對K562細胞的殺傷作用，表現為細胞存活率增加(圖2D)。Transwell細胞侵襲實驗結果表明，PPFIA1過表達顯著增強了細胞侵襲力(圖2E)?？寺⌒纬蓪嶒灲Y果也表明，過表達PPFIA1的K562細胞集落數顯著高于對照組(圖2E)。這些結果表明，PPFIA1和miR-181a的表達水平與K562細胞的惡性表型相關。

圖2

3. PPFIA1 siRNA對CML異種移植小鼠模型的抑制作用

為了探討PPFIA1-siRNA靶向PPFIA1的治療潛力，研究者將106個熒光素酶標記的K562細胞注射到NSG小鼠體內，并通過生物成像監測siRNA治療的效果。結果顯示，與NC siRNA處理組和賦形劑對照組相比，PPFIA1 siRNA顯著抑制K562-熒光素酶細胞的生長(圖3A)；相對熒光素酶水平如圖3B所示，在接種腫瘤時，接受NC-siRNA治療的小鼠的相對熒光素酶水平為1.58e+6，然后在第21天上升到8.01e+8，而在接受PPFIA1 siRNA治療的小鼠中，其相對熒光素酶水平從1.56e+6上升到1.35e+8。這些結果表明，靶向PPFIA1的PPFIA1-siRNA可以抑制K562-熒光素酶細胞在體內的生長。而體重體重作為動物模型癌癥惡病質的重要指標，在腫瘤接種時接受NC-siRNA治療的小鼠的平均體重為27.9g，在第21天下降到26.4g，而接受PPFIA1-siRNA治療的小鼠的平均體重從27.9g增加到28.4g(圖3C)。接受PPFIA1 siRNA處理的NSG小鼠比使用NC-siRNA和空白對照組的小鼠存活時間更長(圖3D)。這些結果表明，PPFIA1 siRNA可能是治療CML的一種有前途的藥物。

圖3

4. 通過磷酸陣列分析檢測到PPFIA1-siRNA降低KIT磷酸化水平

為了了解PPFIA1增強CML細胞侵襲性和克隆原性的機制，研究者進行了磷酸陣列檢測，通過計算兩個樣品(PPFIA1-siRNA/NC和miR-181a mimic/NC)在248個位點特異的磷酸化位點上的磷酸化比率確定兩者之間的差異(圖4A)。在miR-181a模擬轉染組中，23個蛋白位點的磷酸化水平降低，其中7個位點與NC轉染組相比降低了30%(圖4B)。PPFIA1 siRNA轉染降低了60個蛋白位點的磷酸化，其中8個位點降低了50%(圖4C)。值得注意的是，通過對磷酸化降低比例的比較，研究者發現三種磷酸化靶點，KIT Tyr721、P38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK) Tyr182和血管內皮生長因子受體2 (VEGFR2) Tyr951位點，它們的磷酸化通常被miR-181a mimic和PPFIA1-siRNA處理降低(圖4D)。

KIT與CML發病機制有關，KIT表達BCR- ABL轉導的小鼠髓系細胞對酪氨酸激酶抑制劑不太敏感。因此研究者推測miR-181a的靶點PPFIA1可能通過激活K562細胞的KIT信號通路促進惡性表型。在穩定過表達PPFIA1的K562細胞株中，磷酸化KIT Tyr721的表達顯著增加(圖4E)，而使用PPFIA1- siRNA抑制其表達則會產生相反的效果(圖4F)。這些數據表明，PPFIA1可能通過激活CML中的KIT通路而發揮致癌作用。

圖4

5. PPFIA1和BCR/ABL的重要下游分子PARP1

為了探討PPFIA1和KIT之間的關系，研究者在K562細胞中異位過表達FLAG-PPFIA1，并進行BCR/ FLAG免疫沉淀(IP)檢測。采用SDS-PAGE對BCR和FLAG親和純化的IP產物進行分離，并進行質譜分析，結果顯示，在K562細胞中，PARP1同時與外源性PPFIA1和內源性BCR相關(圖5A)。分子對接分析表明，PARP1催化結構域可以與PPFIA1 (PDB: 3TAC)和ABL1 (PDB: 5HU9)結合(圖5B，C)。ABL1的結構域取自PDB (F-actin PDB），分子對接分析結果顯示，ABL1的F-actin結構域可以與PARP1的催化結構域對接(圖5D)，而SH2結構域不能與PARP1的催化結構域對接。由于無法獲得BCR/ABL融合蛋白，研究者純化了ABL的每個結構域，并進行了SPRi分析，結果證實ABL1的F-actin結構域可以與PARP1結合，與分子對接分析結果一致(圖5E)。

有趣的是，除了分子對接分析表明PARP1可以與PPFIA1相互作用外，IP實驗也可以識別這種相互作用。如圖5F-5I所示，PARP1與PPFIA1和ABL1相互作用，而且可能是PPFIA1或BCR/ABL的重要下游分子?；谶@些結果，研究者推測PARP1介導了PPFIA1和KIT過表達之間的關系。

圖5

6. PARP1通過激活NF-kB-P65轉錄促進KIT表達

PARP1在參與DNA修復和轉錄的幾個蛋白上形成分支多聚(ADP)核糖(PAR)聚合物，其中，PARP1是NF-kB轉錄調節復合物的關鍵成分。因此，研究者推測PPFIA1通過涉及PARP1、P65和KIT的軸參與白血病的生長。與假設一致，在K562細胞中強制表達PARP1導致P65表達水平上調，而使用奧拉帕尼(PARP1抑制劑[PARPi])降低PARP1表達則導致P65下調(圖6A-6C)。此外，在K562細胞中強制表達P65導致KIT mRNA和蛋白上調，而P65- siRNA下調P65表達則導致KIT水平下調(圖6D-6F)。這些數據表明，PPFIA1通過與PARP1相互作用參與了KIT水平的調控，而PARP1調節NF-kB-P65的轉錄活性。PPFIA1/PARP1/NF-kB-P65/KIT可能在CML中構成了一個調控軸。

接下來，為了探索靶向PARP1在CML中的治療潛力，研究者研究了奧拉帕尼對穩定表達PPFIA1的K562細胞的影響。奧拉帕尼顯著抑制了表達PPFIA1的慢病毒轉化細胞的集落形成能力(圖6G)。為了驗證奧拉帕尼可能抑制CML在體內的進展這一假設，研究者將Baf3-P210細胞移植到用3Gy X射線照射的BALB/c小鼠中。移植小鼠每天單獨服用奧拉帕利布或卒中生理鹽水溶液(賦形劑對照)，連續7天。接受奧拉帕利治療的動物比空載組的動物存活時間更長(圖6H)。這些結果表明，PARP是克服慢性粒細胞白血病的一種有前途的治療方法。

圖6