免疫共沉淀CoIP技術原理

細胞裂解后，孵育結合了抗體的珠子，誘餌蛋白通過其抗體結合到Beads上，同時誘餌蛋白的互作蛋白，也一起“共沉淀”到Beads上。洗滌掉未結合的蛋白后，再用洗脫液將互作蛋白復合物從Beads洗脫下來，便得到免疫共沉淀CoIP產物。CoIP產物既可用Western Blot檢測已知蛋白，也可用質譜鑒定未知蛋白。

當沒有合適的誘餌蛋白抗體時，可以通過表達融合了Flag標簽的誘餌蛋白，利用Flag標簽做免疫沉淀。即細胞過表達Flag-Bait，經裂解后與anti-Flag珠子孵育，誘餌融合蛋白與Beads結合，其互作蛋白“共沉淀”到Beads上，再經洗滌、洗脫后用WB或質譜檢測。

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免疫共沉淀CoIP實驗流程

內源蛋白抗體免疫共沉淀CoIP實驗流程

標簽抗體免疫共沉淀CoIP實驗流程

應用領域

Co-IP（免疫共沉淀）應用背景

蛋白質是幾乎所有生命活動的直接效應分子，并且在行使功能的時候往往不是單打獨斗的，蛋白質之間經常形成復合體，并且在工作過程中還會不斷的更換相互作用的伙伴，從而行駛不同的功能。因此，研究蛋白質的相互作用成為研究蛋白質功能和作用機制的最為重要的環節之一。

常見的蛋白相互作用方法主要有免疫共沉淀（Co-IP）、pull down、酵母雙雜交、熒光雙分子互補（BiFC）、熒光共定位等。

Co-IP（免疫共沉淀）研究案例—客戶文章解析

膽固醇通過APMAP抑制EGFR降解誘導前列腺癌細胞轉移

研究背景

轉移性前列腺癌具有很高的致命性。已有報道表明，膽固醇與前列腺癌的發展有關；前期研究發現，膽固醇可以誘導前列腺癌細胞發生上皮-間質轉化（EMT），但其作用及潛在機制尚不清楚。

研究線路

研究結論

本研究證明膽固醇介導APMAP上調，APMAP通過與EGFR競爭結合EPS15R，進而抑制EGFR降解，激活ERK1/2通路，促進前列腺癌細胞EMT；提出APMAP可能是一種關鍵的調節劑，為高脂肪飲食、肥胖和癌癥轉移之間提供了聯系。

客戶文獻

Jiang S.Y. et al: Cholesterol Induces Epithelial-to-Mesenchymal Transition of Prostate Cancer Cells by Suppressing Degradation of EGFR through APMAP. Cancer Research. 2019. (IF=12.701).

輝駿實力

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輝駿生物提供的Co-IP免疫共沉淀服務分為以下兩種：

1. Co-IP WB，用于檢測某樣本中的誘餌蛋白和待測蛋白是否存在相互作用；

2. Co-IP MS，用于篩選某樣本中的誘餌蛋白與哪些蛋白具有相互作用。

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免疫共沉淀CoIP實驗*輝駿優勢

1. 近十年服務經驗，服務客戶眾多，案例發表在Nature Cell Biology、Nature Plants、Cancer Research等知名期刊上。

2. 對蛋白互作的篩選鑒定理解深刻，擅長針對客戶具體情況提出合適的方案建議。

3. 自有分子及細胞生物實驗平臺，能有效制定并執行最優的實驗路線。

4. 自有蛋白質組學平臺，對微量CoIP實驗產物的質譜鑒定有十足的把控能力，對后續的生物信息分析有獨到的見解。

5. 售后技術支持將一直保持到客戶發表文章，確?？蛻舭残拿庖吖渤恋硐掠螌嶒灱巴陡?/span>。

CoIP樣本要求

1. 送樣量要求

▲注意：這里列出的均為每組樣本的送樣量，如果實驗和對照組用的樣本一致，此樣本量*2。詳細送樣指南可聯系輝駿生物客服或銷售索取。

2. 樣本保存和運輸要求：

（1）樣本用PBS清洗干凈后，離心去掉液體，先放入液氮中速凍，再轉移至-80℃冰箱中保存；

（2）樣本一定要做好標記，應用油性防凍記號筆或標簽紙在管上注明樣本名稱或編號；

（3）樣本較多或需要分批做，要將樣本分裝；

（4）干冰取樣/運輸；需要至少在送樣前一天通知我方。

coip實驗結果示例

Co-IP WB：Western blot檢測圖（陽性）

Co-IP MS：Western blot檢測圖（陽性）

Co-IP MS：質譜檢索表格（部分展示）

Co-IP（免疫共沉淀）客戶文章

1. Li H.B. et al: The plant ESCRT component FREE1 shuttles to the nucleus to attenuate abscisic acid signaling. Nature Plants. 2019，IF=13.256. 【研究內容】：客戶發現，作為內體蛋白分選轉運復合體成分之一的FREE1基因，受到脫落酸刺激時候會發生磷酸化并移位到細胞核?？蛻衾媒湍鸽p雜交技術找到兩個核蛋白ABF4 and ABI5會與FREE1結合，免疫共沉淀CoIP實驗進一步證實了FREE與這兩個蛋白的互作。后續實驗表明，FREE1通過抑制ABF4、ABI5對下游基因的調控能力，參與了脫落酸信號通路。 使用相關技術：質譜鑒定、免疫共沉淀CoIP、Co-IP MS實驗

2. Jiang, S. et al: Cholesterol Induces Epithelial-to-Mesenchymal Transition of Prostate Cancer Cells by Suppressing Degradation of EGFR through APMAP. Cancer Research.2019，IF= 9.727. 【研究內容】：客戶利用蛋白質組學技術，篩選出膽固醇致前列腺癌發生上皮間質轉變（EMT）的重要基因APMAP和EGFR。通過在前列腺癌細胞表達3*Flag-APMAP基因，并利用免疫共沉淀CoIP及質譜鑒定技術，客戶發現EPS15R可與APMAP結合。進一步的研究證實，體內EPS15R-APMAP復合物通過EGFR致使細胞發生EMT。 使用相關技術：蛋白質組學、質譜鑒定、免疫共沉淀CoIP

3. Huang C.Y. et al: UBAP2L arginine methylation by PRMT1 modulates stress granule assembly. Cell Death Differ. 2020 , IF=10.717. 【研究內容】：前期研究表明UBAP2L蛋白參與應激顆粒形成?？蛻粼谶@項研究中，用免疫共沉淀結合質譜等技術，發現PRMT1甲基化UBAP2L，UBAP2L蛋白并且和另外三個應激顆粒形成有關的重要蛋白有相互作用。這些蛋白復合物介導了應激顆粒的形成。 使用相關技術：CoIP技術服務、質譜鑒定、修飾位點鑒定

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Flag免疫沉淀/免疫共沉淀試劑盒產品簡介

輝駿生物的Flag免疫沉淀/免疫共沉淀試劑盒能夠高效完成細胞或組織中Flag標簽融合的目標蛋白的純化及其互作蛋白的調取。FLAG-tag由8個氨基酸殘基“N-DYKDDDDK-C (1012 Da)”組成，免疫共沉淀實驗前，先通過基因工程技術手段將目的基因和FLAG-tag基因序列連接起來，并導入細胞或組織中表達，再用Flag標簽免疫共沉淀試劑盒來調取和純化誘餌蛋白及其互作蛋白。

Flag試劑盒組成

Flag試劑盒產品優勢*輝駿生物

1. 抗體與樹脂偶聯，因此CoIP產物中幾乎不含抗體污染，Western Blot或LC-MS檢測不受影響；

2. 親和材料經過特殊優化，與誘餌蛋白結合更多且結合力更強，調取的互作蛋白更多；

3. 操作簡便，周期短。

flag試劑盒使用流程簡述

1. 將細胞裂解液與Flag樹脂，室溫下孵育 1-2 小時，或 4 ℃ 過夜；

2. 室溫下，漂洗、洗脫得到目標蛋白及其互作蛋白復合物。

protein G免疫沉淀/免疫共沉淀試劑盒產品簡介

輝駿生物的protein G免疫沉淀/免疫共沉淀試劑盒能夠高效完成抗原的免疫沉淀（ IP）及免疫共沉淀（ Co-IP）實驗。首先，將特異性的抗體加入樣品中與目標抗原形成免疫復合物，然后將其結合在protein G樹脂上。通過漂洗去除未結合物質后，用低 pH 的洗脫液將免疫復合物從protein G樹脂上洗脫下來。

protein G試劑盒組分

Protein G試劑盒產品優勢*輝駿生物

1. 親和效率高，抗體用量小于 10 μg；

2. 可以用于內源性的目標蛋白免疫沉淀/免疫共沉淀；

3. 操作簡便，周期短。

Protein G試劑盒使用流程簡述

1. 將細胞裂解液與所選抗體在室溫下孵育 1-2 小時，或 4 ℃ 過夜。

2. 在室溫下，將抗原/抗體復合物與蛋白G樹脂結合 1-2 小時。

3. 漂洗、洗脫得到目標蛋白及其互作蛋白復合物。